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第五章 蛋白電泳

  • 發布日期:2015-07-14      瀏覽次數:2745
    •                                      第五章 蛋白電泳


      5.1  SDS-PAGE 基本原理

      1. SDS-PAGE 是在蛋白質樣品中加入 SDS 和含有巰基乙醇的樣品處理液,SDS 是一種很強的陰離子表面活性劑,它可以斷開分子內和分子間的氫鍵,破壞蛋白質分子的二級和三級結構。

      2.  強還原劑巰基乙醇(或二硫蘇糖醇,DTT)可以斷開二硫鍵破壞蛋白質的四級結構。使蛋白質分子被解聚成肽鏈形成單鏈分子。解聚后的側鏈與 SDS 充分結合形成帶負電荷的蛋白質-SDS 復合物。

      3.  蛋白質分子結合 SDS 陰離子后,所帶負電荷的量遠遠超過了它原有的凈電荷,從而消除了不同種蛋白質之間所帶凈電荷的差異。蛋白質的電泳遷移率主要決定于亞基的相對分子質量,而與其所帶電荷的性質無關。

      5.2  PAGE:聚丙烯酰胺凝膠

      聚丙烯酰胺凝膠(polyacrylamide gel)是由單體丙烯酰胺(acrylamide,簡稱Acr)和交聯劑crosslinker)N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺(N,N’-methylenebisacylamide,簡稱 Bis)在催化劑(過硫酸胺或核黃 AP)和加速劑(四甲基乙二胺 TEMED)作用下聚合交聯而成的三維網狀結構的凝膠。化學惰性強,具有一定的機械強度和透明度。是良好的電泳介質。聚丙烯酰胺凝膠聚合機理是通過提供氧游離基(free radicals)的催化,使體系發生氧化還原作用(catalyst-redox systems)來完成的。催化體系主要有化學催化(AP-TEMED)和光化學催化(核黃素-TMTED體系。

                                            

      5.3 聚丙烯酰胺凝膠分類

         PAGE 分為連續系統和不連續系統兩大類。連續系統電泳體系中緩沖液 pH 值與凝膠中的相同。帶電顆粒在電場作用下,主要靠電荷和分子篩效應。不連續系統中帶電顆粒在電場中泳動不僅有電荷效應、分子篩效應,還具有濃縮效應,因而其分離條帶清晰度及分辨率均較前者佳。

                                               

      不連續系統的濃縮效應:

      凝膠層的不連續性:濃縮膠的孔徑大,分離膠的孔徑小。在電場的作用下,蛋白質顆粒在大孔膠中遇到的阻力小,移動快。而在小孔膠中遇到的阻力大,移動慢。因此,在兩層凝膠的交界處,由于凝膠孔徑的不連續性使樣品遷移受阻而壓縮成很窄的區帶。緩沖液離子成分和pH的不連續性:HCl易解離出Cl-,它在電場中遷移率大,走在zui前面,故稱為快離子或前導離子。電極緩沖液中的甘氨酸在pH6.8 的緩沖液中解離度很小,僅為 0.1-1%,因而在電場中遷移率很小,稱為慢離子或尾隨離子。蛋白質均帶負電荷,在電場中均移向正極,其有效遷移率介于快慢離 子之間,于是蛋白質就在快慢離子間形成的界面處,被濃縮成極窄的區帶。當進入pH8.8的分離膠時,甘氨酸解離度增加,其有效遷移率超過蛋白質,因此氯離子和甘氨酸離子沿著離子界面繼續前進。蛋白質分子由于分子量大,被留在后面,然后分離成多個區帶。


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